Selecci�n gen�tica de la raza Frisona: Marcadores gen�ticos asociados a la paratuberculosis bovina

Art�culo t�cnico publicado en la revista Frisona Espa�ola 266 (mar-abr 2025)

Resumen del estudio en el que se revisan los �ltimos esfuerzos realizados en NEIKER para identificar animales menos susceptibles y m�s resistentes a la paratuberculosis bovina y para generar una herramienta bioinform�tica predictiva que permita estimar el riesgo que al nacimiento presenta un animal de padecer la paratuberculosis o de ser resistente a ella.

La paratuberculosis bovina

La PTB, tambi�n conocida como enfermedad de Johne, es una enfermedad infecciosa cr�nica causada por Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP). Afecta principalmente a rumiantes dom�sticos y silvestres, con un impacto significativo en los bovinos lecheros debido a las p�rdidas econ�micas asociadas a la disminuci�n de la producci�n lechera, con una reducci�n media de 452 kg por lactaci�n, la p�rdida de peso y la mortalidad. Adem�s, la calidad de la leche se ve afectada negativamente, evidenciando un aumento en el recuento de c�lulas som�ticas y una disminuci�n en la cantidad de grasa y prote�na l�ctea. Adem�s. la p�rdida de peso en los animales infectados afecta a su rendimiento general, lo que se traduce en un menor peso al destete y sacrificio y menor valor de la canal.

Asimismo, la enfermedad incrementa los costes veterinarios y de manejo, debido a la necesidad de tratamientos continuos y control riguroso. La fertilidad tambi�n se ve comprometida, con un mayor intervalo entre partos, una mayor tasa de abortos y dificultades en el parto.

La PTB es una enfermedad de distribuci�n mundial; se estima que afecta a m�s del 50 % de las explotaciones de bovino en Europa y Estados Unidos, donde las p�rdidas econ�micas se estiman en 198 millones de d�lares anuales, mientras que en la Uni�n Europea ascienden a 364 millones de d�lares. En Espa�a, las p�rdidas anuales debidas a la PTB se estiman en 12 millones de d�lares, de modo que se sit�a, junto a Alemania y Jap�n, como uno de los pa�ses que notifican m�s casos a la Organizaci�n Mundial de Sanidad Animal (OMSA).

La transmisi�n de MAP se produce principalmente por v�a fecal-oral, cuando los animales ingieren alimentos, leche o agua contaminados con heces de animales infectados. Los animales j�venes son m�s susceptibles y, aunque los signos cl�nicos pueden tardar de 2 a 5 a�os en manifestarse, eliminan MAP en las heces, calostro y leche, y, por lo tanto, transmiten la enfermedad a otros animales en la ganader�a. En animales adultos, los signos cl�nicos est�n asociados a una enteritis granulomatosa cr�nica que afecta principalmente a los �ltimos tramos del intestino delgado, yeyuno e �leon, y a los linfonodos asociados; incluyen diarrea cr�nica, p�rdida de peso progresiva y, finalmente, la muerte del animal infectado. La infecci�n es predominantemente subcl�nica; por cada animal con signos cl�nicos, al menos otros 25 pueden estar infectados y no ser detectados con las t�cnicas diagn�sticas tradicionales. Una vez ingerido, MAP cruza la mucosa intestinal y es fagocitado por los macr�fagos subepiteliales. Para evitar la supervivencia de MAP en el interior de los macr�fagos infectados, los linfocitos Th1 del hospedador producen interfer�n-gamma (IFNγ), el cual est� implicado en la activaci�n y reclutamiento de macr�fagos al sitio de la infecci�n con la consiguiente producci�n de citoquinas proinflamatorias, interleucina 12 y factor de necrosis tumoral. La respuesta inmune de tipo celular mediada por IFNγ es clave en el control de las infecciones intracelulares como la causada por MAP, cuyo potencial zoon�sico es preocupante.

Diferentes estudios sugieren una asociaci�n entre esta enfermedad y otras afecciones gastrointestinales y autoinmunes humanas, como la enfermedad de Crohn, la esclerosis m�ltiple, la diabetes tipo 1 y la artritis reumatoide. Este hecho, sumado a la posibilidad de que MAP pueda transmitirse al ser humano a trav�s del agua y la leche contaminadas, ha hecho que algunos pa�ses adopten una actitud preventiva bloqueando la comercializaci�n de leche proveniente de explotaciones con casos de PTB. Estas restricciones para la exportaci�n a terceros pa�ses de productos derivados pueden suponer un problema para la industria y un importante retroceso econ�mico.

Por su impacto sanitario y socio-econ�mico, la PTB es considerada una enfermedad de declaraci�n obligatoria seg�n lo establecido en el Reglamento 2016/429, respaldado por la OMSA y la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA). Asimismo, ha sido categorizada como una enfermedad de "Categor�a E" de acuerdo con el Reglamento de Ejecuci�n (UE) 2018/1882, por lo que se trata de una enfermedad objeto de vigilancia. Sin embargo, a pesar de su relevancia, la PTB no est� sometida a un programa de control oficial en nuestro pa�s.

Esto se debe principalmente a la falta de directrices comunes para su control, as� como a la dificultad para detectar a los animales infectados en las etapas iniciales de la infecci�n y a animales subcl�nicos, con las herramientas diagn�sticas disponibles.

Diagn�stico y control de la paratuberculosis bovina

No existe un tratamiento eficaz para esta enfermedad, y la vacunaci�n est� prohibida en el ganado bovino en la mayor�a de los pa�ses, debido a su interferencia con el diagn�stico de la tuberculosis bovina. Por ello, el control de la PTB se realiza eliminando animales positivos a las t�cnicas de diagn�stico (estrategia “test and cull”) e instaurando medidas higi�nico-sanitarias y de bioseguridad en las ganader�as dirigidas a evitar que los animales m�s susceptibles, generalmente los menores de 1 a�o, entren en contacto con las heces de los animales infectados. En regiones con baja prevalencia, se emplea la estrategia test-and-cull para identificar y sacrificar peri�dicamente a los animales infectados. Aunque esta estrategia reduce la transmisi�n de MAP y disminuye la prevalencia de la enfermedad, su implementaci�n puede ser cos-tosa y no garantiza la erradicaci�n a largo plazo. Por lo tanto, se combina con pr�cticas de manejo y bioseguridad, las cuales se centran principalmente en evitar la exposici�n de la recr�a a MAP. Los programas de control de la PTB bovina existen desde principios del siglo XX, aunque su aplicaci�n ha sido heterog�nea. Los principales pa�ses europeos productores de leche, como Alemania, Pa�ses Bajos o Italia, entre otros, cuentan con programas de control establecidos. Sin embargo, en Espa�a solo existen programas de control voluntarios de car�cter auton�mico.

Las t�cnicas de diagn�stico disponibles son el ELISA para la detecci�n de anticuerpos anti-MAP en el suero de los animales infectados y la reacci�n en cadena de la polimerasa (PCR) para la detecci�n de ADN de MAP en heces, que presentan problemas para la detecci�n de animales subcl�nicos o en etapas iniciales de la infecci�n por MAP. Estas t�cnicas, sin embargo, no son suficientemente sensibles para detectar animales infectados que no muestran signos de enfermedad y en los que la carga bacteriana y los niveles de anticuerpos producidos est�n por debajo de los niveles de detecci�n.

El m�todo diagnostico ideal, cada vez m�s necesario, tiene que ser r�pido y sensible de tal forma que permita a los ganaderos asegurarse de que los animales que compra est�n libres de infecci�n y de que las reproductoras no est�n infectadas y no transmiten la infecci�n a los terneros.

¿Es posible seleccionar animales menos susceptibles y m�s resistentes a la PTB bovina?

La PTB es una enfermedad multifactorial que se produce como resultado de la interacci�n de factores microbianos, gen�ticos, y ambientales.

La gen�tica espec�fica de cada animal es uno de los factores m�s importantes implicados en la resistencia a la infecci�n por MAP, por lo que una de las estrategias de control m�s com�nmente aceptada es la que se basa en la selecci�n de aquellos animales menos susceptibles y m�s resistentes a la infecci�n por MAP.

NEIKER ha llevado a cabo un an�lisis de asociaci�n a genoma completo (genome-wide association studies, GWAS) utilizando datos de genotipado de unas 1.000 vacas frisonas y fenotipos pre-mortem (ELISA para la detecci�n de anticuerpos frente a MAP) y postmortem (PCR y cultivo de tejido para la detecci�n de MAP, y an�lisis histopatol�gico de lesiones intestinales). En un primer estudio, la combinaci�n de ELISA-PCR-cultivo (h² = 0.139) permiti� identificar 398 SNPs asociados a la susceptibilidad a la infecci�n por MAP. En un segundo estudio se identificaron un total de 449 y 752 SNPs asociados con la presencia de lesiones multifocales (h² = 0.057) y difusas (h² = 0.189), respectivamente.

Mediante an�lisis de varianza, se estim� que la gen�tica explicaba entre el 7 al 87 % de las diferencias entre animales, siendo los caracteres de resistencia como la reducci�n de la carga bacteriana en los macr�fagos de animales infectados y la producci�n de IFNγ, los caracteres con h² m�s altas, h²= 87 % y h²= 64 %, respectivamente.

NEIKER se encuentra ahora en el momento id�neo para, en colaboraci�n con CONAFE, emplear estos marcadores gen�ticos en la categorizaci�n y selecci�n de animales menos susceptibles y m�s resistentes a la PTB para las diferentes realidades productivas del sector lechero en Espa�a.

Desarrollo de una herramienta bioinform�tica predictiva

De hecho, NEIKER y CONAFE, en colaboraci�n con el Departamento de Mejora Gen�tica Animal del INIA, han desarrollado una herramienta inform�tica predictiva e integrada que permite estimar valores de selecci�n (Genomic Estimated Breeding Values, gEBVs) o valores de riesgo polig�nico. Estos gEBVs se pueden usar para catalogar, ordenar y seleccionar a vacas y toros de la raza frisona pertenecientes a cualquier poblaci�n y genotipados con el chip de media densidad (MD) EuroG de acuerdo a los caracteres de susceptibilidad y resistencia a la infecci�n por MAP. Es decir, cualquier animal genotipado con el chip EuroG MD puede ser evaluado para su potencial gen�tico de mayor o menor susceptibilidad y resistencia a la PTB en funci�n de las variantes al�licas que porte, aunque no se le haya realizado ning�n tipo de anal�tica o an�lisis laboratorial.

En la Figura 1 se describen brevemente los datos que emplea la herramienta y en qu� consiste. A partir de las variantes al�licas obtenidas con el chip EuroG MD de la poblaci�n de referencia y sus datos fenot�picos (medidas o datos cualitativos) para cada car�cter analizado se genera un modelo lineal predictivo (Genomic Best Linear Unbiased Prediction, GBLUP) que permiten estimar los gEBVs de la poblaci�n de estudio.

En la Figura 2 se describe en m�s detalle el funcionamiento de la herramienta. A partir de las variantes al�licas de los animales de la poblaci�n de referencia obtenidas con el chip EuroG MD, se filtran los SNPs con una frecuencia del alelo menor por debajo del 0,01 y que no aparecen en al menos el 80 % de los animales (call rate < 0.8) empleando el software Plink1.9. A partir de las medidas o datos cualitativos (positivo o negativo) de cada car�cter analizado y los variantes al�licas de la poblaci�n de referencia filtradas, se calculan los gEBVs en la poblaci�n de referencia y se genera una matriz de relaciones gen�micas empleando el modelo predictivo GBLUP del software GCTA1.93.2. (19). La matriz y los gEBVs se utilizan para determinar el efecto (valor de b) de cada SNP asociado a cada car�cter. Los valores de b de cada SNP se utilizan posteriormente para predecir los gEBVs de cualquier poblaci�n conociendo �nicamente las variantes gen�ticas que porta en los SNPs asociados. A partir de las variantes al�licas de los animales de la poblaci�n de estudio obtenidas con el chip EuroG MD, se filtran los SNPs con una frecuencia del alelo menor por debajo del 0.01 y con call rate <0.8 y se identifican las variantes que previamente hab�an mostrado asociaci�n en la poblaci�n de referencia. A continuaci�n, se calculan los gEBVs de la poblaci�n de estudio empleando el software Plink1.9. Los pasos que implica el proceso desde que se obtienen los datos de genotipado hasta que se catalogan los animales se agilizaron empleando comandos de R para acabar por generar una herramienta bioinform�tica integrada.

Adem�s de los modelos lineales, en la fase de optimizaci�n de la herramienta se testaron otros modelos, pero debido a que el modelo lineal requer�a un menor tiempo computacional, fue el que se decidi� finalmente incluir en la herramienta.

Por �ltimo, se genera un informe que incluye los gEBV para los dos caracteres de susceptibilidad evaluados (positividad a ELISA, PCR y cultivo de MAP, presencia de lesiones difusas) y dos de resistencia a la infecci�n por MAP (reducci�n de la carga en macr�fagos, producci�n de IFNγ). Se modifica el signo de los gEBVs de todos los caracteres menos para la producci�n IFNγ, de forma que los gEBVs m�s altos sean los m�s favorables y se relacionen en todos los casos con resistencia a menor probabilidad de presentar lesiones difusas y de dar positivo a los test diagn�sticos y mayor capacidad para reducir la carga de MAP en macr�fagos y de producir m�s IFNγ. En funci�n de los cuartiles en los que se encuentran los gEBVs de un animal para estos cuatro caracteres se categoriza como (+), (–) o (0). Un animal se considera (+) cuando sus valores de gEBVs se encuentran en el cuartil m�s alto para tres de los cuatro caracteres. Por el contrario, se categoriza como (–) cuando se encuentra en el cuartil m�s bajo para tres de los cuatro caracteres. El resto de animales se clasifica como (0). Empleando la herramienta bioinform�tica desarrollada, se categorizaron unos 5.358 machos y hembras de raza frisona seleccionados entre los genotipos disponibles para formar una poblaci�n representativa de la raza y presente en las genealog�as de la poblaci�n activa actual. Aproximadamente el 5,5 % de los animales de esta poblaci�n eran (+) y el 5,5 % (–), siendo el 88,8 % de la poblaci�n (0). Tambi�n se observ� que los padres (–) no tienen hijos (+) y que los padres (+) apenas tienen hijos (–). CONAFE ceder� a cada ganadero que genotipe sus animales con el chip de EuroG MD de Eurogenomics la categorizaci�n de los mismos de acuerdo a sus gEBVs, de manera que pueda tomar decisiones relacionadas con desviejes o con selecci�n de las mejoras reproductoras.

Inclusi�n de la resistencia a la paratuberculosis en el programa de cr�a de la raza frisona espa�ola y beneficios esperables

Hist�ricamente, la mejora gen�tica en vacuno lechero ha estado orientada a incrementar la producci�n de leche, tanto en cantidad como en calidad. En la actualidad, hay un inter�s creciente en incluir nuevos caracteres funcionales entre los objetivos de selecci�n. La mayor�a de los pa�ses europeos, USA y Canad� ya incorporan la resistencia gen�tica a la mamitis y a otras enfermedades en sus programas de selecci�n gen�tica. Pa�ses como Reino Unido y Francia han incorporado reciente-mente la resistencia gen�tica a la tuberculosis y a la PTB bovina, respectivamente. En Espa�a, caracteres funcionales como la longevidad y el n�mero de d�as abiertos se han incorporado en los �ndices de selecci�n como el �ndice gen�tico combinado (ICO). Tambi�n se incluyen caracteres relacionados con la salud animal como el recuento de c�lulas som�ticas para evitar problemas de mamitis, otra de las enfermedades que causa mayores p�rdidas econ�micas al ganadero, y el �ndice de salud podal que nos indica la resistencia de los animales a las cojeras por enfermedades en las pezu�as. El presente y el futuro de la mejora gen�tica del vacuno de leche pasa sin duda por su estudio gen�mico, incorporando nuevos marcadores a los actuales �ndices de selecci�n gen�tica.

NEIKER se ha comprometido a promover la participaci�n activa de ganaderos y otros actores del sector en el desarrollo y validaci�n de la nueva herramienta bioinform�tica, garantizando la formaci�n de los actores y la practicidad y utilidad de la herramienta desarrollada en condiciones reales. Para este objetivo, NEIKER, en colaboraci�n con CONAFE ha obtenido financiaci�n en el marco de grupos operativos supraauton�micos 2024 para el proyecto INMUNOGEN* de la Asociaci�n Europea para la Innovaci�n en materia de productividad y sostenibilidad agr�colas (AEI-Agri), en el marco del Plan Estrat�gico de la PAC 2023-2027.

Beneficios esperables

Se espera mejorar la inmunocompetencia de los animales, no solo frente a la PTB sino tambi�n frente a otras enfermedades, disminuyendo la necesidad de tratamientos con antibi�ticos. Esto redundar� en una mejora de la salud, la longevidad y el bienestar animal, as� como en la reducci�n de las p�rdidas econ�micas que soportan las explotaciones ganaderas ocasionadas por los desviejes prematuros y el descenso de la productividad, y las causadas por el elevado costo de las medidas de saneamiento, que son las �nicas de las que se dispone actualmente para el control de la PTB. De esta forma, la reposici�n recaer� en las novillas sanas, productivas y de alta resiliencia a enfermedades de la propia explotaci�n. Esto redundar� en una mejora de la eficiencia productiva de la ganader�a y unos mayores beneficios, al ser capaces de aumentar el n�mero de lactaciones por animal y reducir el remplazo.

Al detectar y seleccionar a los animales m�s resistentes al nacimiento, se puede minimizar el desperdicio de recursos alimenticios e h�dricos que, de otro modo, se destinar�an a animales enfermos. La mejora de la eficiencia en la producci�n ganadera es un aspecto crucial, especialmente cuando nos enfrentamos a una enfermedad cr�nica como la PTB, que da�a seriamente la productividad de las explotaciones. Adem�s, al mejorar la salud general del ganado, se disminuye la necesidad de recursos adicionales para compensar la p�rdida de producci�n debido a enfermedades.

Al disminuir el impacto productivo, minimizar la necesidad de tratamientos m�dicos y el uso de recursos naturales, se reduce la huella ambiental general de la industria ganadera, contribuyendo as� a mitigar el cambio clim�tico y sus efectos adversos. Garantizar la salud de los animales de producci�n asegura la generaci�n de alimentos seguros y de mayor calidad para la poblaci�n. Por otro lado, al contribuir directamente al control de la PTB mediante la mejora de la inmunocompetencia general de los animales, se contribuye de forma indirecta al control de otras enfermedades, se reduce la propagaci�n de enfermedades zoon�sicas, protegiendo as� la Salud P�blica y minimizando el riesgo de transmisi�n de enfermedades entre animales y humanos. Adem�s, la PTB impone restricciones en los mercados internacionales para la exportaci�n de animales y productos l�cteos. Abordar el control de esta enfermedad mediante estrategias de mejora gen�tica mejorar� la competitividad del sector ganadero, permitiendo el acceso a nuevos mercados y generando beneficios econ�micos directos para el pa�s, lo que repercutir� positivamente en la calidad de vida de los ciudadanos. Al mejorar la salud y productividad de los reba�os, se espera un aumento en los ingresos y la rentabilidad de las ganader�as locales, lo que garantizar� un suministro estable de productos l�cteos y c�rnicos seguros, fortaleciendo as� la seguridad alimentaria y la demanda de alimentos a nivel mundial. Este incremento en la rentabilidad no solo alienta la permanencia de las familias en las zonas rurales al ofrecer oportunidades econ�micas m�s atractivas, sino que tambi�n puede estimular el relevo generacional, revitalizando el inter�s de los j�venes por el sector agr�cola y ganadero. Adem�s, la introducci�n de nuevas tecnolog�as y pr�cticas no solo crea empleo y desarrolla habilidades t�cnicas en las �reas rurales, impulsando el desarrollo econ�mico local, sino que tambi�n promueve pr�cticas ganaderas m�s sostenibles y un mejor bienestar animal, lo que refleja un compromiso �tico y responsable con el medio ambiente. La mejora gen�tica basada en la inclusi�n de marcadores gen�ticos de resistencia a enfermedades es un proceso a medio-largo plazo que depende de la presi�n selectiva que se le quiera dar al car�cter, pero sus resultados son acumulativos y permanentes a trav�s de generaciones, pudiendo conducir a la erradicaci�n de enfermedades. En concreto, la selecci�n de animales m�s resistentes a la infecci�n por MAP beneficiar�a especialmente a aquellas �reas geogr�ficas donde la enfermedad es muy prevalente y donde la vacunaci�n no est� permitida por su interferencia con los m�todos de diagn�stico de la tuberculosis bovina. Una posible futura certificaci�n a cerca del estatus infeccioso respecto a esta enfermedad ser�a deseable desde todos los puntos de vista: de cara a ofrecer productos seguros al consumidor, obtener una posici�n privilegiada para la venta de animales y a la vez disponer de establos libres donde comprar animales.

Perspectivas

El Departamento de Sanidad Animal de NEIKER trabaja tambi�n en la identificaci�n de variantes g�nicas asociadas a otras enfermedades. De hecho, recientemente se han identificado marcadores gen�ticos asociados a vacas de la raza frisona que son capaces de producir mayores niveles de IFNγ en respuesta a la PPDBOV, un derivado proteico de Mycobacterium bovis, el agente causante de la tuberculosis bovina. Asimismo, se investiga en variantes gen�ticas asociadas a la tuberculosis bovina en otras razas como la raza de lidia. Desde el punto de vista tecnol�gico, la aplicabilidad directa y preventiva de los marcadores gen�ticos identificados y validados por NEIKER permitir� el desarrollo de futuras aplicaciones, herramientas y soluciones innovadoras que posibiliten una detecci�n m�s temprana y precisa de animales resistentes a la PTB, lo que facilitar� la toma de decisiones en tiempo real y mejorar� la gesti�n sanitaria del ganado.

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Art�culo t�cnico publicado por Gerard Badia-Bringu�¹, Jos� Antonio Jim�nez², �scar Gonz�lez-Recio³, Marta Alonso-Hearn¹en el n�mero 266 de la revista Frisona Espa�ola, correspondiente a los meses de enero y febrero de 2025.

¹ Dpto. de Sanidad Animal, NEIKER-Instituto Vasco de Investigaci�n y Desarrollo Agrario, Basque Re- search and Technology Alliance (BRTA); ² Dpto. T�cnico de CONAFE; ³ Dpto. de Mejora Gen�tica Animal, Instituto Nacional de Investigaci�n y Tecnolog�a Agraria y Alimentaria (INIA).